周焕斌研究团队在水稻基因组编辑工具盒再添新成员

    近日,我室周焕斌研究员团队在国际知名学术期刊Molecular Plant《分子植物》(IF="“9.326”)上发表了题为 “Cas9-NG greatly expands the targeting scope of genome-editing toolkit by recognizing NG and other atypical PAMs in rice”“Cas9-NG核酸酶通过识别NG和其它非典型性PAM序列极大扩展各水稻基因编辑技术的应用范围”的研究论文,该研究从PAM识别序列角度,利用Cas9-NG对水稻CRISPR基因组定点编辑技术各种相关工具进行了全面升级。
    基于CRISPR/Cas9的水稻基因组编辑技术的出现和应用,使得水稻功能基因组学研究和分子育种变得更加高效便捷。现今常用的各种基因组编辑工具大多基于SpCas9蛋白架构,需要识别编辑靶位点的NGG PAM序列而行使功能。这对于特定位点核苷酸进行单碱基编辑时,往往造成无打靶sgRNA可利用,由此存在一定局限性。
    为了扩展水稻基因组定点编辑技术,尤其是各种单碱基编辑器在水稻上的使用范围,该团队首先探索了识别NG PAM的Cas9-NG和xCas9两个蛋白核酸酶对水稻基因组的切割属性。发现Cas9-NG优于xCas9蛋白,除了传统NGG位点外,对NGA和NGT位点表现出喜人的识别特性,对NGC位点也具有一定的切割能力。进一步研究表明,Cas9-NG在水稻中对NAC, NTG, NTT和NCG等PAM也能识别。由此,该团队开发了一系列基于Cas9-NG架构的各种水稻基因组定点编辑工具,并成功用于水稻单基因敲除、多基因敲除、单碱基编辑以及靶基因转录激活调控。如:水稻胞嘧啶碱基编辑器rBE22(hAID*∆-Cas9n-NG-UGI)实现 OsBZR1 靶碱基C向T的定向替换,获得了预期 OsBZR1(P206L) 材料。腺嘌呤碱基编辑器rBE23(TadA:TadA7.10-Cas9n-NG)将 OsSERK2 的一个病原响应磷酸化位点的靶碱基A替换为G,效率达40.43%等。
    Cas9-NG在水稻上的成功应用,在一定程度上突破PAM识别序列的限制,实现了水稻基因组可编辑位点八倍提高,众多之前无法进行碱基编辑的位点如今可进行操作,大大扩展了靶向范围,这对于水稻基因功能解析和分子精准育种具有重要促进作用,加速实现水稻缺陷型基因的修饰矫正,有利于缩短水稻育种进程和延长现有优良品种的应用周期。
    该研究由植物病虫害生物学国家重点实验室周焕斌课题组、周雪平课题组和四川大学生命科学学院林宏辉课题组合作完成。我室客座博士研究生任斌和硕士研究生柳浪为共同第一作者,周焕斌研究员和林宏辉教授为本文的共同通讯作者。本研究得到相关工作得到了基金委自然科学基金(31871948),国家重点研发计划项目(2017YFD0200900)和中国农科院创新工程的资助。